REATIVAÇÃO DE MECP2: POR QUE ALGUNS GENES REATIVAM E OUTROS NÃO?

A síndrome de Rett é causada por mutações em uma das duas cópias do gene MECP2 localizado no cromossomo X. Durante o desenvolvimento embrionário precoce, as células femininas inativam aleatoriamente um de seus cromossomos X para compensar a dose dupla de ter dois cromossomos X em comparação com células masculinas. Isso significa que as células doentes que expressam a cópia mutada do MECP2 também contêm uma cópia saudável, ou selvagem, no cromossomo X silenciado. Acordar, ou reativar, essa cópia silenciada do MECP2 é um campo que tem recebido cada vez mais atenção científica. Esta é uma das seis abordagens estratégicas de cura do Rett Syndrome Research Trust (RSRT).

Sou Hegias Mira-Bontenbal, professora assistente do grupo de Joost Gribnau no Departamento de Biologia do Desenvolvimento do Centro Médico da Universidade Erasmus em Roterdã, Holanda. Recentemente publiquei um artigo com meus colegas onde estudamos como o gene MECP2 é reativado em células-tronco neuronais de camundongos (NSCs). Há vários anos, recebemos financiamento da RSRT para criar um novo sistema de modelo mais sensível para estudar a reativação mecp2. As razões foram várias vezes. Precisávamos de um novo modelo de rato que nos permitisse estudar as células que são críticas para Rett, neurônios. Além disso, queríamos criar um novo modelo onde, em vez de usar uma proteína fluorescente para medir a reativação do cromossomo X (XCR), poderíamos usar uma proteína bioluminescente que é muito mais sensível do que a fluorescência ou outras proteínas bioluminescentes disponíveis. Bioluminescência é o fenômeno pelo qual vagalumes fazem luz! Nosso objetivo final era, assim, gerar um modelo que pudesse ser usado para tela para centenas de milhares de drogas que poderiam reativar a cópia silenciosa e saudável do MECP2.

Fundimos o gene MECP2 com um sistema de repórteres duplos, combinando uma proteína bioluminescente muito sensível, nanoluciferase, e outra proteína fluorescente, TdTomato, que, como o próprio nome indica, gera luz fluorescente vermelha. Usando células-tronco embrionárias, geramos camundongos carregando este repórter duplo, e através de um truque genético forçamos a inativação do cromossomo X (XCI) para a inativação do repórter – o que significa que nenhuma célula produziu "luz". Isolamos NSCs de embriões de camundongos e os mantivemos na cultura para caracterizá-los completamente. Para mostrar que nosso sistema pode ser usado para reativar o MECP2, utilizamos dois mecanismos que levaram à produção de bioluminescência e fluorescência a partir de NSCs.

Como havia sido publicado por nossos colaboradores dentro do RSRT no passado, primeiro reduzimos a expressão de Xist, que é um gene crítico para o XCI. Acreditávamos, como outros, que reduzir sua expressão poderia tornar o cromossomo X mais agradável à reativação. E, em segundo lugar, bloqueamos uma enzima que é importante para a manutenção da metilação de DNA. A metilação do DNA é uma modificação química dos pares da base de DNA – chamamos de modificação epigenética. A metilação do DNA em posições onde os genes começam é detectada pelas células como um sinal i-should-be-desligado, levando à repressão genética. A metilação de DNA é, portanto, um mecanismo que é usado pela célula para bloquear genes no X em um modo reprimido. Bloqueando a enzima que carrega essa função, reduzimos ou eliminamos a metilação do DNA levando à reexpressão genética.

Foi exatamente o que aconteceu com o MECP2! No entanto, isso aconteceu em uma pequena porcentagem de células e, como esperado, para muitos outros genes no cromossomo X. Detectamos 86 genes entre os 2600 genes ligados ao X que foram reativados ao longo do MECP2 e ficaram intrigados com as características que compartilhavam.

Por que esses genes reativaram mais facilmente do que outros? O que é que eles compartilham que leva à reativação destes e não de outros? Nós olhamos para as marcas epigenéticas e genéticas que este conjunto de genes reativados compartilha e os comparamos com genes não reativados. Observamos que genes reativados tendem a ter marcas epigenéticas mais ativas quando estão localizados no X ativo: Eles provavelmente são mais eficientes em fatores de recrutamento importantes para a ativação. Algumas pequenas regiões no X também foram enriquecidas para genes reativados em comparação com outras regiões. Embora tenhamos usado um bloqueador da enzima que mantém a metilação do DNA e observou desmetilação global, não houve desmetilação significativa de genes que mostrassem reativação. Este resultado aparentemente contraditório pode ser conciliado com o fato de que uma pequena diminuição na metilação do DNA pode ser suficiente para fatores ligados aos genes para reativá-los.

Quando nos concentramos nas características genômicas dos genes reativados, a correlação mais significativa e surpreendente foi com os PECADOS, elementos nucleares intercalados curtos. Estas são pequenas regiões repetitivas e eram mais frequentemente próximas de genes reativados do que genes não reativados. O que esses SINEs fazem para a reativação e como isso acontece mecanicamente ainda é uma questão em aberto.

Finalmente, comparamos nossa estratégia para xcr com outras técnicas publicadas para reativar o X, como a reprogramação de células-tronco pluripotentes induzidas, e notamos que ambas as piscinas de genes reativados se sobrepõem substancialmente, mesmo que a reprogramação comece a partir de fibroblastos, um tipo de célula muito diferente em comparação com células-tronco neuronais. Isso indica que a reativação do cromossomo X em diferentes tipos de células ou por meios diferentes segue caminhos semelhantes.


Referencias:

  1. Mira-Bontenbal, H, et al., Genetic and epigenetic determinantsn of reactivation of Mecp2 and the inactive X chromosome in neural stem cells. Stem Cell Reports, 2022, Vol.17, 693-706.

  2. Carrette, LLG, et al., A mixed modality approach towards Xi reactivation for Rett syndrome and other X-linked disorders. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018. 115(4): p. 668-675.

Fonte: https://reverserett.org/news/articles/mecp2-reactivation-why-do-some-genes-reactivate/


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